Penanaman bakteria: kaedah, prinsip, langkah dan syarat

2024 Pengarang: Angel Austin | [email protected]. Diubah suai terakhir: 2023-12-17 05:36

Mikroorganisma dalam alam sekitar kita ada di mana-mana: dalam tanah, badan air, pada permukaan pelbagai objek, manusia dan haiwan didiami olehnya. Semua ini boleh berfungsi sebagai sumber pencemaran mikrob makanan, ubat-ubatan, dan barisan pengeluaran. Penanaman bakteria adalah perlu untuk mengkaji sifat, keperluan, dan ciri-cirinya. Ini, seterusnya, merupakan langkah penting dalam pembangunan pelbagai ubat, diagnosis makmal penyakit, pengiraan reaktor pengeluaran dan banyak lagi.

Konsep umum

Penanaman bakteria dalam mikrobiologi merujuk kepada penanaman mikroorganisma yang dijalankan di makmal. Sebaliknya, mikrob yang telah tumbuh pada medium nutrien terpilih dipanggil budaya. Kultur boleh dicampur jika ia dibentuk oleh pelbagai jenis mikroorganisma, dan tulen jika ia diwakili oleh hanya satu jenis bakteria.

Jika berkhasiatHanya satu sel diletakkan di dalam medium, dan sekumpulan individu diperoleh hasil daripada pembiakannya, maka set mikroorganisma ini dipanggil klon. Apabila klon berkembang ke titik di mana ia boleh dilihat dengan mata kasar, koleksi bakteria ini dipanggil koloni.

Biasanya penanaman bakteria yang diasingkan daripada sumber yang berbeza dijalankan secara berasingan antara satu sama lain. Setiap kumpulan mikrob yang ditanam secara berasingan dipanggil strain. Jadi, jika satu jenis staphylococcus diasingkan daripada tiga sumber (atau bahagian berbeza produk yang sama, orang yang berbeza), mereka bercakap tentang tiga strain staphylococcus jenis ini.

Faktor Pertumbuhan Bakteria

Ini termasuk pelbagai asid amino, lipid, bes purin dan sebatian lain yang diperlukan untuk pembangunan mikroorganisma. Sesetengah mikrob boleh secara bebas menghasilkan bahan yang mereka perlukan, manakala yang lain perlu menerimanya dalam bentuk siap. Mengikut keperluan mikroorganisma dalam faktor pertumbuhan tertentu, pengenalpastian dan pembezaan bakteria dijalankan. Selain itu, parameter ini penting untuk penyediaan medium nutrien yang betul untuk kerja makmal dan bioteknologi:

• Asid amino. Bakteria mungkin memerlukan satu asid amino atau kumpulan asid tertentu. Jadi, clostridia memerlukan leucine dan tyrosine, streptokokus memerlukan leucine dan arginin. Mikroorganisma yang memerlukan asid amino dari luar untuk berkembang dipanggil auxotrophs.
• Bes purin dan pirimidin, serta derivatifnya (adenine, guanina dan lain-lain). Mereka adalah faktor penting dalam pertumbuhan banyak orangSpesies Streptococcus.
• Vitamin. Mereka adalah sebahagian daripada koenzim yang diperlukan oleh bakteria. Jadi, asid nikotinik, serta amidanya, yang merupakan sebahagian daripada NAD dan NADP, diperlukan oleh difteria dan shigella corynebacteria. Tiamin, sebagai bahagian penting pirofosfat, diperlukan oleh Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Asid pantothenik, yang merupakan sebahagian daripada koenzim CoA, diperlukan oleh basil tetanus dan jenis streptokokus tertentu. Cytochromes, dan oleh itu asid folik, hemes dan biotin yang membentuknya, diperlukan untuk Mycobacterium tuberculosis dan Haemophilus influenzae.

Keperluan Alam Sekitar

Syarat untuk media kultur untuk membiak bakteria:

1. Pemakanan. Mereka mesti mengandungi bahan, lebih-lebih lagi, dalam bentuk yang mudah dihadam, yang diperlukan untuk mikroorganisma memberi makan dan menambah tenaga. Ini termasuk organogen dan mineral. Sesetengah mikroorganisma juga memerlukan vitamin dan asid amino yang tidak dapat disintesiskannya.
2. Tahap pH optimum. Ia menjejaskan kebolehtelapan membran sel dan, dengan itu, keupayaan untuk menyerap nutrien oleh bakteria. Selalunya, nilai pH hendaklah pada tahap 7, 2–7, 4. Banyak mikroorganisma dalam perjalanan hidup mereka menghasilkan produk dengan tindak balas berasid atau beralkali, dan agar pH medium nutrien tidak berubah, ia mesti ditimbal.
3. Isotonik. Tekanan osmotik dalam medium nutrien untuk penanaman bakteria harus mempunyai nilai yang sama sepertidalam sel mikrob. Ia biasanya sepadan dengan larutan NaCl 0.5%.
4. Kemandulan. Ini disebabkan oleh fakta bahawa penampilan bakteria asing akan memesongkan hasil kajian strain yang dianalisis.
5. Tahap kelembapan. Penunjuk ini, bersama-sama dengan ketekalan medium, harus mempunyai ciri optimum untuk jenis bakteria tertentu.
6. Potensi redoks (RH2). Ia menunjukkan nisbah bahan yang menderma dan menerima elektron, serta tahap ketepuan oksigen medium nutrien. Untuk aerobes dan anaerobes, syarat untuk membiak bakteria agak berbeza dalam penunjuk ini. Mikroorganisma anaerobik membiak terbaik pada nilai RH2 di bawah 5 dan mikroorganisma aerobik sekurang-kurangnya 10.
7. Keseragaman. Adalah penting bahawa medium kultur mengandungi jumlah tetap bahan individunya. Di samping itu, penyelesaian yang jelas lebih diutamakan, yang memudahkan untuk memantau pertumbuhan tanaman atau melihat pencemaran.

Jenis media budaya

Pemilihan medium tertentu untuk pertumbuhan mikroorganisma dipengaruhi oleh banyak faktor, antaranya ialah ciri pemakanannya dan tujuan kajian. Ciri utama yang mendasari klasifikasi media nutrien ialah:

1. Komponen. Mengikut bahan awal yang digunakan untuk mencipta substrat, mereka membezakan:

• semulajadi, yang disediakan daripada produk haiwan atau sayuran (cth. daging, susu, buah) dan sesuai untuk penanaman campurantanaman;
• separa sintetik, di mana produk makanan semula jadi yang mahal digantikan dengan produk bukan makanan (contohnya, tepung tulang, pembekuan darah), dan yang optimum untuk membiak jenis bakteria tertentu atau mengasingkan produk metaboliknya daripada persekitaran;
• sintetik, yang disediakan daripada jumlah sebatian kimia yang tepat, mempunyai komposisi malar yang diketahui dan mudah dihasilkan semula.

2. Ketekalan (ketumpatan). Bezakan persekitaran:

• cecair;
• padat;
• separa cecair.

Dua terakhir disediakan daripada larutan khas atau bahan cecair dengan penambahan agar-agar atau gelatin untuk menghasilkan ketumpatan yang diperlukan. Selain itu, persekitaran yang padat untuk pertumbuhan bakteria ialah serum darah beku, kentang, media gel silika, karagenan.

3. Kompaun. Atas dasar ini, persekitaran adalah:

• simple, senarainya pendek ialah Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), gelatin berkhasiat dan air peptone.
• kompleks, disediakan daripada yang ringkas dengan tambahan darah, whey, karbohidrat dan bahan lain.

4. Temujanji. Media nutrien berikut dibezakan:

• utama digunakan untuk menumbuhkan banyak mikrob patogen (biasanya komposisi ringkas);
• yang istimewa digunakan untuk mengasingkan dan memupuk bakteria yang tidak tumbuh pada substrat mudah;
• selektif (ia juga selektif) sesuai untuk mengasingkan jenis bakteria tertentu dan menghalang pertumbuhan mikrob yang berkaitan (selektivitidicipta dengan menambahkan bahan tertentu pada media, seperti antibiotik atau garam, atau dengan melaraskan pH);
• diagnostik pembezaan membolehkan untuk membezakan satu jenis bakteria daripada yang lain dengan menilai aktiviti enzimatik, contohnya, medium;
• pengawet diperlukan untuk inokulasi awal dengan pengangkutan sampel seterusnya, kerana ia menghalang kematian mikroorganisma, serta menghalang pertumbuhan bakteria lain.

Persediaan media

Langkah paling penting dalam penanaman bakteria anaerobik ialah penyediaan medium nutrien yang sesuai. Selepas parameter optimum dipilih, teruskan ke peringkat berikut:

• menimbang, dengan memilih sampel komponen pada neraca analitik;
• pelarutan dijalankan dalam air suling yang dipanaskan hingga 70 ° C, dan fosfat, garam mikro dan makro dilarutkan secara berasingan;
• mendidih dalam tab mandi air selama dua minit;
• penentuan pH menggunakan kertas penunjuk atau potensiometer;
• penapisan melalui penapis kain basah atau kertas untuk cecair serta media tumpat cair, dan melalui penapis kapas-kasa untuk media agar;
• pembotolan dilakukan pada kapasiti 3/4;
• pensterilan bergantung sederhana;
• kawalan untuk kemandulan dijalankan dengan mengendap selama dua hari dalam termostat, diikuti dengan melihat;
• kawalan kimia untuk menetapkan pH dan kandungan yang diperlukanitem;
• kawalan biologi melalui inokulasi percubaan.

Pensterilan alat kaca dan media

Salah satu prinsip asas penanaman bakteria ialah kemandulan. Pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisma asing boleh menjejaskan ciri-ciri medium nutrien dengan mengubah komposisi kimia dan pHnya. Pensterilan adalah syarat utama untuk menanam kultur tulen. Dalam amalan, istilah ini bermaksud kaedah pemusnahan sama sekali semua bentuk kehidupan di permukaan dan dalam jumlah objek yang disterilkan. Kapal, instrumen yang digunakan, media dan barang lain yang digunakan semasa kajian disterilkan.

Beberapa jenis pensterilan:

• Pencucuhan. Pensterilan gelung dan jarum untuk pembenihan, slaid kaca, beberapa instrumen boleh dilakukan menggunakan penunu atau lampu semangat.
• Mendidih. Sesuai untuk mengendalikan picagari, jarum, makanan, tetapi tidak membunuh spora bakteria.
• Pensterilan haba kering. Ia dijalankan di dalam kabinet pengeringan khas dan sesuai untuk memproses kelalang, tabung uji dan barangan kaca makmal yang lain.
• Pensterilan wap. Dijalankan dalam autoklaf, kaedah ini sangat berkesan. Tetapi ia tidak sesuai untuk media nutrien yang mengandungi protein atau sebarang sebatian lain yang terurai pada suhu tinggi. Lebih hemat boleh dipanggil tyndalization. Ia dijalankan dalam Dandang Koch dan menggabungkan percambahan spora dengan pemusnahannya.
• Pempasteuran. Ia digunakan untuk media yang mengubah sifatnya apabila direbus (contohnya, susu, wain, bir), mampumenyingkirkan mereka daripada mikroorganisma yang tidak mempunyai spora. Suhu pemprosesan hanya 50-60 ° C selama lima belas hingga tiga puluh minit. Dalam sesetengah kes, pensterilan sejuk digunakan, dijalankan menggunakan penapis atau sinar UV.

Keadaan penanaman bakteria

Pertumbuhan dan perkembangan bakteria hanya mungkin di bawah faktor tertentu dan nilai setiap daripadanya:

1. Suhu. Terdapat tiga kumpulan bakteria yang berbeza dalam keutamaan suhu:

• thermophiles, atau mikrob yang suka haba, tumbuh pada suhu 45-90°C, yang bermaksud mereka tidak membiak dalam organisma manusia dan haiwan;
• psychrophiles, atau mikroorganisma yang menyukai sejuk, lebih suka suhu dalam julat 5-15 ° C dan ditanam di kedai sejuk;
• mesophiles, berkembang pada suhu 25-37 ° C, ia termasuk sebahagian besar bakteria.

2. Cahaya. Ia adalah ciri penanaman bakteria fototropik, kerana mereka menjalankan proses fotosintesis. Tetapi bagi kebanyakan mikrob, pencahayaan bukanlah prasyarat. Dan malah sebaliknya, ultraungu suria boleh menyekat perkembangannya.

3. air. Semua mikroorganisma memerlukan air dalam bentuk yang boleh diakses (cecair). Itulah sebabnya makanan sejuk beku mempunyai sedikit atau tiada pertumbuhan bakteria.

4. Keasidan persekitaran. Prinsip pembiakan bakteria ini telah pun dibincangkan secara terperinci di atas.

5. Pengudaraan. Oksigen, sebagai unsur kimia, adalah sebahagian daripada air dan sejumlah besar sebatian digunakan untukpenanaman mikroorganisma. Oksigen gas juga boleh terkandung dalam air dan cecair lain dalam bentuk terlarut. Sebahagian besar bakteria memerlukan bekalan molekul oksigen yang berterusan. Tetapi untuk beberapa mikroorganisma, ia tidak diperlukan, atau, lebih teruk lagi, oksigen gas adalah toksik kepada mereka, kerana mereka tidak mempunyai katalase dan peroksidase, yang memusnahkan produk pernafasan toksik. Oleh itu, langkah paling penting dalam penanaman bakteria anaerobik ialah penyingkiran molekul O₂ daripada medium nutrien.

6. Penanaman mikroorganisma. Penanaman bakteria aerobik dan anaerobik dijalankan dalam lapisan persekitaran yang berbeza dan dalam mod yang berbeza.

Penanaman mikroorganisma aerobik

Penanaman bakteria aerobik memerlukan oksigen molekul. Untuk mendapatkan kultur tulen aerobes yang boleh berjaya digunakan dalam perubatan dan industri makanan, kaedah berikut digunakan:

• permukaan tumbuh pada media padat atau dalam media cecair (lapisan nipisnya) apabila oksigen datang terus dari udara;
• penanaman dalam dalam media cecair, apabila peningkatan jumlah oksigen terlarut di dalamnya dicapai dengan pengudaraan berterusan.

Penanaman mikroorganisma anaerobik

Prinsip asas untuk membiak bakteria jenis ini ialah sentuhan minimumnya dengan oksigen atmosfera. Menyediakan keadaan untuk pertumbuhan mereka jauh lebih sukar daripada aerobes. Kaedah berikut digunakan untuk mengasingkan anaerobes daripada molekul O₂:

1. Fizikal. Kaedah penanaman bakteria anaerobik ini dikurangkan kepada penanaman mereka dalam alat vakum khas - mikroanaerostat. Udara di dalamnya digantikan dengan campuran gas khas nitrogen dengan penambahan 10% hidrogen dan 5% karbon dioksida.
2. Kimia. Ini termasuk: penggunaan agen penyerap (cth. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) atau agen pengurangan (seperti asid askorbik).
3. Biologikal. Ia datang kepada penanaman bersama aerobes dan anaerobes dalam sistem tertutup. Kaedah pembiakan bakteria ini melibatkan pembenihan satu separuh hidangan Petri dengan beberapa spesies bakteria aerobik, dan separuh lagi dengan anaerob yang dikaji. Perkembangannya akan bermula pada saat semua oksigen habis.

Kaedah pembenihan berikut sesuai untuk membiak bakteria anaerobik:

• dalam lapisan permukaan;
• dalam lapisan permukaan yang diisi dengan parafin steril;
• dalam tebal medium nutrien yang padat;
• dalam lapisan dalam media likat.

Mendapatkan budaya murni

Ahli mikrobiologi biasanya bekerja dengan sampel yang didiami oleh pelbagai jenis mikrob. Walau bagaimanapun, untuk menentukan kedudukan sistematik mikroorganisma (keluarga, genus, spesies), serta untuk mengkaji ciri-ciri mereka, adalah perlu untuk mengasingkan mereka dan mengembangkan budaya tulen. Mereka sangat penting dalam banyak industri makanan, contohnya, keju, roti, kvass, wain, dll. Penanaman bakteria asid laktik memungkinkan untuk mendapatkankomponen penting untuk penghasilan produk susu yang ditapai, doh, koko, silaj dan juga plastik.

Kaedah mengasingkan kultur tulen dalam medium tumpat adalah berdasarkan pemisahan mekanikal sel mikroorganisma dengan penanaman terpencil seterusnya. Sampel dipindahkan ke dalam isipadu air atau garam steril (isipadu 10-100 ml) dan kemudian digoncang selama dua minit. Untuk mengekstrak mikroorganisma yang terletak dalam ketebalan bahan yang dikaji (contohnya, sosej atau keju), mula-mula menggosok kepingan sampel dengan instrumen steril dengan pasir dilakukan. Bahan yang telah menjalani penyediaan awal, seberat 1 g atau isipadu 1 ml, dicairkan dengan air steril sebanyak 10, 100, 1000, dsb. Tahap pencairan dipilih yang memberikan kepekatan sel yang sepadan dengan keupayaan kaedah.

Penanaman mikroorganisma seterusnya adalah untuk menyediakan medium nutrien. Biasanya medium tumpat (MPA) dipilih. Ia mula-mula dicairkan dan disejukkan hingga 45-50 °C, dan hanya kemudian ia dituangkan ke dalam beberapa cawan Petri (tiga hingga lima keping), di bahagian bawahnya sapuan dari bahan ujian pelbagai kepekatan diletakkan. Seterusnya, pencampuran medium nutrien yang masih belum beku dan bahan yang dimasukkan ke dalamnya dijalankan. Beginilah cara sel dibetulkan pada pelbagai titik dalam isipadu substrat.

Seterusnya, cawan Petri diletakkan dalam termostat selama 2 hari pada suhu 22 °C. Pada masa ini, sel-sel membiak sehingga satu tahap sehingga koloni yang terbentuk oleh setiap sel menjadi kelihatan dengan mata kasar. Setiap daripada mereka adalah budaya tulen jenis bakteria dari sel mana iamawar.

Selepas itu, daripada piring Petri, mikroorganisma disubkultur ke dalam tabung uji berasingan yang diisi dengan medium nutrien. Dengan cara ini, kultur tulen diasingkan daripada sampel campuran. Kaedah ini membawa nama pemajunya - R. Koch. Ia juga biasa dipanggil kaedah cawan, atau menabur habis. Selepas memperoleh kultur tulen pelbagai jenis bakteria, bentuk, spora dan familinya ditentukan.

Semua kerja mesti dijalankan mengikut prinsip asepsis. Untuk mengelakkan perkembangan pramatang mikroorganisma, kajian perlu dijalankan sejurus selepas pensampelan. Air paip dianalisis selepas mengeringkan bahagian pertama, kerana ia mungkin mengandungi mikrob terkumpul dalam paip dan paip. Mikroflora buah-buahan, beri dan sayur-sayuran terutamanya terletak di permukaan (kupas), oleh itu, pembasuhan dilakukan daripadanya. Untuk melakukan ini, letakkan janin dalam bekas steril dan isi dengan jumlah air yang diperlukan. Kemudian mereka digoncang agak kuat dan air dituangkan ke dalam bekas lain. Tanaman daripada produk kain juga diperoleh secara swab, tetapi sebelum ini, kepingan saiz tertentu dipotong daripadanya.