Calitan gram digunakan secara meluas dalam mikrobiologi kerana ia merupakan salah satu cara paling mudah untuk membezakan bakteria berdasarkan komposisi dinding selnya. Menurut Gram, semua bakteria boleh dibahagikan kepada gram-positif (Gram (+)) dan gram-negatif (Gram (-)). Kaedah pewarnaan Gram telah dibangunkan pada tahun 1884 dan tidak kehilangan populariti sejak itu, walaupun ia telah diubah suai beberapa kali.
Struktur dinding sel
Pewarnaan Gram mendedahkan sama ada bakteria Gram-positif atau Gram-negatif. Pembahagian bakteria kepada Gram (+) dan Gram (-) dijalankan mengikut struktur dinding selnya.
Dinding sel mengandungi jumlah terbesar peptidoglycan (murein) - bahan kompleks, yang termasuk peptapeptida dan glycan. Glikan terdiri daripada sisa berselang-seli N-asetilglukosamin dan asid N-asetilmuramat yang dihubungkan antara satu sama lain oleh β-1,Ikatan 4-glikosidik. Peptidoglikan menyediakan penyelenggaraan bentuk sel, perlindungan osmotik dan fungsi antigen.
Perbezaan utama antara bakteria Gram-positif dan Gram-negatif
Bakteria yang berbeza mempunyai ketebalan lapisan peptidoglikan yang berbeza. Dalam bakteria yang dikelaskan sebagai gram-positif, ia berkisar antara 15 hingga 80 nm, manakala dalam gram-negatif ia adalah dari 2 hingga 8 nm. Pada masa yang sama, bakteria Gram-negatif mempunyai struktur khas di bawah lapisan peptidoglycan, yang bakteria Gram-positif tidak mempunyai - ruang periplasmik. Ruang ini dipenuhi dengan enzim hidrolitik - β-laktamase, ribonuklease 1, fosfatase. Enzim inilah yang bertanggungjawab terhadap rintangan bakteria Gram-negatif terhadap banyak antibiotik.
Lapisan peptidoglycan Gram(-) bakteria terikat kepada lipopolisakarida, struktur antigen yang mengandungi endotoksin. Dalam bakteria Gram(+), asid teikoik melakukan fungsi yang serupa.
Bakteria Gram-negatif mempunyai struktur tambahan - membran luar.
Intipati kaedah pewarnaan
Sebelum anda mula mengotorkan, calitan bakteria yang dikaji disediakan. Untuk melakukan ini, air dititiskan ke atas slaid kaca dan budaya mikroorganisma ditambah di sana dengan gelung bakteria. Kemudian, selepas air telah benar-benar kering, smear dibetulkan - slaid kaca dibawa beberapa kali di atas api penunu. Pewarnaan gram lebih berkesan daripada pewarnaan bakteria hidup - molekul pewarna mengikat lebih baik pada sel mati.
Mewarna dilakukan dalam beberapa peringkat:
- Kepingan kecil kertas turas diletakkan pada sapuan tetap dan pewarna utama dituangkan - violet gentian atau biru metilena.
- Selepas 3-5 minit, keluarkan kertas penapis berwarna dan isikan smear dengan larutan Lugol selama 1 minit. Dalam kes ini, penyediaan menjadi gelap.
- Larutan Lugol disalirkan dan sapuan dirawat dengan etil alkohol tulen: beberapa titis dititiskan pada penyediaan, disalirkan selepas 20 saat. Prosedur diulang 2-3 kali.
- Bilas slaid dengan penyediaan ujian dengan air suling.
- Hasilkan pewarnaan tambahan - selesaikan penyediaan dengan fuchsin. Selepas 1-2 minit, pewarna dicuci.
- Selepas air kering, periksa smear di bawah mikroskop. Bakteria Gram-positif akan menjadi biru-ungu, bakteria Gram-negatif akan menjadi merah jambu atau merah.
Punca corak pewarnaan yang berbeza
Seperti yang diterangkan di atas, pewarnaan Gram bakteria mengotorkan bakteria Gram-positif biru-ungu dan bakteria Gram-negatif merah atau merah jambu. Sebab pewarnaan pembezaan bakteria dengan kaedah ini adalah bahawa selepas bentuk violet gentian yang larut memasuki sel, pewarna masuk ke dalam bentuk iodin yang tidak larut. Semasa rawatan bakteria dengan etil alkohol, lipid diekstrak daripada membran di bawah tindakan pelarut bukan polar ini. Membran kemudian menjadi berliang dan tidak lagi menjadi penghalang yang ketara kepada larut lesap pewarna. Namun begitupeptidoglycan lebih tahan terhadap pelarut non-polar, termasuk alkohol. Dialah yang menghalang pencucian daripada pewarna, jadi bakteria dengan lapisan murein yang tebal bertukar menjadi biru-ungu (gram-positif), dan selepas rawatan dengan alkohol mereka tidak berubah warnanya.
Lapisan murein nipis bakteria gram-negatif tidak dapat menahan molekul pewarna dalam sel, jadi selepas tindakan alkohol ia menjadi tidak berwarna - ia mengotorkan gram-negatif.
Selepas pendedahan sapuan kepada fuchsin, bakteria yang diwarnakan Gram kekal biru-ungu, manakala bakteria Gram-negatif menjadi merah jambu-merah.
Contoh bakteria Gram(+) dan Gram(-)
Bakteria Gram-negatif termasuk cyanobacteria, bakteria sulfur, bakteria besi, klamidia, riketsia, bakteria asetik, banyak metilobacteria, bakteria thionic, arsenitobacteria, carboxybacteria.
Bifidobakteria, banyak bakteria akuatik, streptokokus dan staphylococci adalah Gram-positif.
