Kaedah penyelidikan biologi molekul memainkan peranan besar dalam perubatan moden, forensik dan biologi. Terima kasih kepada kemajuan dalam kajian DNA dan RNA, seseorang dapat mengkaji genom sesuatu organisma, menentukan agen penyebab penyakit, mengenal pasti asid nukleik yang dikehendaki dalam campuran asid, dsb.
Kaedah penyelidikan biologi molekul. Apakah itu?
Dulu pada tahun 70-an dan 80-an, saintis buat pertama kalinya berjaya mentafsir genom manusia. Peristiwa ini memberi dorongan kepada pembangunan kejuruteraan genetik dan biologi molekul. Kajian tentang sifat DNA dan RNA telah membawa kepada fakta bahawa kini mungkin untuk menggunakan asid nukleik ini untuk mendiagnosis penyakit, mengkaji gen.
Mendapatkan DNA dan RNA
Kaedah diagnostik biologi molekul memerlukan kehadiran bahan permulaan: lebih kerap ia adalah asid nukleik. Terdapat beberapa cara untuk mengasingkan bahan ini daripada sel organisma hidup. Setiap daripada mereka mempunyai kelebihan dan kekurangan sendiri, dan ia perlumengambil kira apabila memilih kaedah untuk mengasingkan asid nukleik tulen.
1. Mendapatkan DNA mengikut Marmur. Kaedah ini terdiri daripada merawat campuran bahan dengan alkohol, akibatnya DNA tulen mengendap. Kelemahan kaedah ini ialah penggunaan bahan agresif: fenol dan kloroform.
2. Pengasingan DNA mengikut Boom. Bahan utama yang digunakan di sini ialah guanidine thiocyanate (GuSCN). Ia menyumbang kepada pemendakan asid deoksiribonukleik pada substrat khusus, dari mana ia kemudiannya boleh dikumpulkan menggunakan penimbal khas. Walau bagaimanapun, GuSCN ialah perencat PTC, malah sebahagian kecil daripadanya yang masuk ke dalam DNA termendak boleh menjejaskan perjalanan tindak balas rantai polimerase, yang memainkan peranan penting dalam bekerja dengan asid nukleik.
3. Pemendapan kekotoran. Kaedah ini berbeza daripada yang sebelumnya kerana ia bukan molekul asid deoksiribonukleik yang dimendakan, tetapi kekotoran. Untuk melakukan ini, penukar ion digunakan. Kelemahannya ialah tidak semua bahan boleh mendakan.
4. Saringan beramai-ramai. Kaedah ini digunakan dalam kes di mana maklumat tepat tentang komposisi molekul DNA tidak diperlukan, tetapi perlu untuk mendapatkan beberapa data statistik. Ini dijelaskan oleh fakta bahawa struktur asid nukleik boleh rosak apabila dirawat dengan detergen, khususnya alkali.
Klasifikasi kaedah penyelidikan
Semua kaedah penyelidikan biologi molekul dibahagikan kepada tiga kumpulan besar:
1. Amplifikasi (menggunakan banyak enzim). Di sinimerujuk kepada PCR - tindak balas rantai polimerase, yang memainkan peranan besar dalam kebanyakan kaedah diagnostik.
2. Tidak menguatkan. Kumpulan kaedah ini secara langsung berkaitan dengan operasi campuran asid nukleik. Contohnya ialah 3 tompok, hibridisasi in situ, dsb.
3. Kaedah berdasarkan pengecaman isyarat daripada molekul probe yang mengikat DNA atau RNA probe tertentu. Contohnya ialah Sistem Tangkapan Hibrida (hc2).
Enzim yang boleh digunakan dalam kaedah penyelidikan biologi molekul
Banyak kaedah diagnostik molekul melibatkan penggunaan pelbagai jenis enzim. Di bawah ialah yang paling biasa digunakan:
1. Enzim sekatan - "memotong" molekul DNA ke bahagian yang diperlukan.
2. DNA polimerase - mensintesis molekul asid deoksiribonukleik berikat dua.
3. Transkripase terbalik (revertase) - digunakan untuk mensintesis DNA pada templat RNA.
4. Ligase DNA - bertanggungjawab untuk pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida.
5. Exonuclease - mengeluarkan nukleotida daripada bahagian terminal molekul asid deoksiribonukleik.
PCR ialah kaedah utama penguatan DNA
Tindak balas rantai polimerase (PCR) digunakan secara aktif dalam biologi molekul moden. Ini ialah kaedah di mana sejumlah besar salinan boleh diperoleh daripada molekul DNA tunggal (molekul dikuatkan).
Fungsi utama PCR:
- diagnostikpenyakit;
- pengklonan segmen DNA, gen.
Unsur berikut diperlukan untuk menjalankan tindak balas rantai polimerase: molekul DNA awal, polimerase DNA termostabil (Taq atau Pfu), fosfat deoksiribonukleotida (sumber bes nitrogen), primer (2 primer setiap 1 molekul DNA) dan sistem penimbal itu sendiri, di mana semua tindak balas adalah mungkin.
PCR terdiri daripada tiga langkah: denaturasi, penyepuhlindapan primer dan pemanjangan.
1. Denaturasi. Pada suhu 94-95 darjah Celcius, ikatan hidrogen antara dua helai DNA terputus, dan akibatnya kita mendapat dua molekul untai tunggal.
2. Penyepuhlindapan primer. Pada suhu 50-60 darjah Celsius, primer dilekatkan pada hujung molekul asid nukleik untai tunggal mengikut jenis pelengkap.
3. Pemanjangan. Pada suhu 72 darjah, sintesis molekul terkandas dua anak perempuan asid deoksiribonukleik berlaku.
Jujukan DNA
Kaedah penyelidikan biologi molekul selalunya memerlukan pengetahuan tentang jujukan nukleotida dalam molekul asid deoksiribonukleik. Penjujukan dijalankan untuk menentukan kod genetik. Diagnostik molekul masa depan akan berdasarkan pengetahuan yang diperoleh daripada penjujukan manusia.
Jenis penjujukan berikut dibezakan:
- Penjujukan Maxam-Gilbert;
- Jujukan Sanger;
- pyrosequencing;
- nanoporepenjujukan.
