Apakah yang mendasari hibridisasi DNA? Walaupun urutan DNA untai dua secara amnya stabil di bawah keadaan fisiologi, mengubah keadaan ini di makmal (biasanya dengan menaikkan suhu ambien) akan menyebabkan molekul-molekul berpisah menjadi helai individu. Yang terakhir adalah pelengkap antara satu sama lain, tetapi mungkin juga melengkapkan urutan lain yang terdapat dalam persekitaran mereka. Menurunkan suhu ambien membolehkan molekul beruntai tunggal menyelinap atau "menghibridkan" antara satu sama lain. Ini ialah kaedah hibridisasi DNA.
Konsep dari sudut pandangan biologi molekul
Para saintis yang terlibat dalam kedua-dua replikasi DNA dan transkripsi DNA ke dalam RNA bergantung pada persilangan nukleotida dan teknik biologi molekul. Ini termasuk tompok Selatan dan Utara, tindak balas rantai polimerase (PCR) dan kebanyakan pendekatan hibridisasi dan penjujukan DNA-RNA.
Permohonan
Hibridisasi ialah sifat utama nukleotidaurutan dan digunakan dalam pelbagai kaedah biologi molekul. Hubungan genetik keseluruhan dua spesies boleh ditentukan dengan menghibridkan segmen DNA mereka (penghibridan DNA-DNA). Disebabkan persamaan jujukan antara organisma yang berkait rapat, suhu yang lebih tinggi diperlukan untuk mencairkan hibrid DNA tersebut berbanding dengan organisma yang lebih jauh. Pelbagai kaedah menggunakan hibridisasi untuk menentukan asal usul sampel DNA, termasuk tindak balas rantai polimerase (PCR). Dalam kaedah lain, jujukan DNA pendek dihibridkan kepada mRNA selular untuk mengenal pasti gen yang dinyatakan. Syarikat farmaseutikal sedang meneroka penggunaan RNA antisense untuk mengikat mRNA yang tidak diingini, menghalang ribosom daripada menterjemah mRNA kepada protein.
Hibridisasi DNA-DNA secara amnya merujuk kepada teknik biologi molekul yang mengukur tahap persamaan genetik antara kumpulan jujukan DNA. Ia biasanya digunakan untuk menentukan jarak genetik antara dua organisma. Ia telah digunakan secara meluas dalam filogeni dan taksonomi.
Metodologi
DNA daripada satu organisma telah dilabelkan, kemudian dicampur dengan DNA tidak berlabel yang boleh dibandingkan dengannya. Campuran diinkubasi untuk membolehkan untaian DNA berpisah dan kemudian sejuk untuk membentuk DNA untai ganda hibrid yang dijana semula. Jujukan hibrid dengan tahap persamaan yang tinggi akan mengikat lebih ketat dan memerlukan lebih banyak tenaga untuk memisahkannya: iaitu, ia berpisah apabila dipanaskan pada suhu yang lebih tinggisuhu daripada jujukan yang berbeza, satu proses yang dikenali sebagai "pencairan DNA".
Pencairan DNA
Menilai profil lebur DNA terhibrid, DNA untai dua diikat pada apa yang dipanggil "lajur" dan campuran yang terhasil dipanaskan. Pada setiap langkah, lajur dibasuh dan urutan DNA yang cair menjadi untai tunggal dan membersihkan lajur. Suhu di mana DNA berlabel keluar dari lajur mencerminkan jumlah persamaan antara jujukan (dan corak lipatan sendiri berfungsi sebagai kawalan). Keputusan ini digabungkan untuk menentukan tahap persamaan genetik antara organisma. Menurut mikrobiologi moden, penghibridan DNA adalah mustahil tanpa memahami perkara ini.
Apabila pelbagai spesies asid ribonukleik (atau deoksiribonukleik) dibandingkan dengan cara ini, nilai persamaan membolehkan spesies diletakkan dalam pokok filogenetik. Oleh itu, ini adalah salah satu pendekatan yang mungkin untuk menjalankan sistematik molekul. Charles Sibley dan John Ahlquist, pelopor teknik ini, menggunakan hibridisasi DNA-DNA untuk mengkaji hubungan filogenetik burung (taksonomi Sibley-Ahlquist) dan primata.
Kepentingan untuk biologi
Hibridisasi DNA-DNA ialah piawaian emas untuk membezakan spesies bakteria, dengan nilai persamaan lebih daripada 70%, menunjukkan bahawa strain yang dibandingkan tergolong dalam spesies yang berbeza. Pada 2014, ambang 79% persamaan telah dicadangkan untuk mengasingkan subspesies bakteria.
Pengkritik berpendapat bahawa teknik itu tidak tepat untuk membandingkan spesies yang berkait rapat, kerana sebarang percubaan untuk mengukur perbezaan antara jujukan ortolog antara organisma terharu dengan penghibridan rakan paralogus dalam genom organisma. Penjujukan DNA dan perbandingan jujukan pengiraan kini merupakan kaedah yang biasa digunakan untuk menentukan jarak genetik, walaupun pendekatan ini masih digunakan dalam mikrobiologi untuk membantu mengenal pasti bakteria.
Cara semasa ialah menjalankan hibridisasi DNA-DNA dalam silikon menggunakan genom terjujukan sepenuhnya atau sebahagiannya. GGDC yang dibangunkan oleh DSMZ ialah alat yang paling tepat diketahui untuk mengira nilai seperti DDH. Antara penambahbaikan algoritma lain, ia menyelesaikan masalah dengan jujukan paralogis dengan menapisnya dengan teliti daripada padanan antara dua jujukan genom.
kaedah IKAN
Pendarfluor Dalam Situ Hibridisasi (IKAN) ialah teknik makmal yang digunakan untuk mengesan dan menyusun DNA, selalunya pada kromosom tertentu.
Pada tahun 1969, Joseph Gall dan Mary Lou Pardu menerbitkan kertas kerja yang menunjukkan bahawa salinan radioaktif bagi jujukan DNA ribosom boleh digunakan untuk mengesan jujukan DNA pelengkap dalam nukleus telur katak. Sejak pemerhatian asal ini, banyak penambahbaikan telah meningkatkan kepelbagaian dansensitiviti prosedur sedemikian sehingga penghibridan in situ ("di tempat", Latin) kini dianggap sebagai alat penting dalam sitogenetik. (Istilah in situ kini juga digunakan untuk merujuk kepada peringkat awal pertumbuhan karsinoma, apabila hanya tisu epitelium yang terlibat dalam proses patologi.)
Jujukan hibridisasi pendarfluor
Probe
RNA boleh direka bentuk untuk sebarang gen atau sebarang jujukan dalam gen untuk memvisualisasikan lncRNA dan mRNA miRNA dalam tisu dan sel. IKAN digunakan dengan mengkaji kitaran pembiakan sel, khususnya interfasa nuklear untuk sebarang keabnormalan kromosom. FISH membolehkan anda menganalisis satu siri besar kes arkib, lebih mudah untuk mengenal pasti kromosom yang dikenal pasti dengan mencipta probe dengan pangkalan kromosom tiruan yang akan menarik kromosom serupa.
Isyarat penghibridan untuk setiap probe apabila keabnormalan nuklear dikesan: setiap probe pengesanan mRNA dan lncRNA terdiri daripada 20 pasang oligonukleotida, setiap pasangan meliputi ruang 40-50 bp. p. Probe menggunakan kimia proprietari untuk mengesan mRNA.
Hibridisasi dengan probe DNA
Prob selalunya dibuat daripada serpihan DNA yang telah diasingkan, disucikan dan diperkuatkan untuk digunakan dalam reka bentuk genom manusia. Saiz genom manusia adalah sangat besar berbanding dengan panjang yang boleh dijujukan secara langsung sehingga perlu membahagikannya kepadaserpihan. Akhirnya, serpihan ini disusun dengan mencerna salinan setiap serpihan ke dalam unit yang lebih kecil menggunakan endonuklease khusus jujukan untuk mengukur saiz setiap serpihan kecil menggunakan kromatografi pengecualian saiz menggunakan maklumat ini untuk menentukan tempat serpihan besar bertindih antara satu sama lain..
Untuk mengekalkan unsur-unsur dengan jujukan DNA masing-masing, serpihan telah ditambahkan pada sistem populasi bakteria yang sentiasa berulang. Populasi klon bakteria, setiap populasi mengekalkan satu kromosom tiruan, disimpan di pelbagai makmal di seluruh dunia. Kromosom buatan (BAC) boleh ditanam, diekstrak dan dilabelkan di mana-mana makmal yang mengandungi perpustakaan. Perpustakaan genomik sering dinamakan sempena institusi tempat ia dibangunkan. Contohnya ialah perpustakaan RPCI-11, dinamakan sempena Institut Kanser Roswell di Buffalo (New York, Amerika Syarikat). Serpihan ini membentuk kira-kira 100 ribu pasangan asas dan merupakan asas kepada kebanyakan probe IKAN.
