Apabila mengkaji bahan dalam kimia organik, lebih daripada sedozen tindak balas kualitatif yang berbeza digunakan untuk menentukan kandungan sebatian tertentu. Analisis visual sedemikian membolehkan anda memahami dengan segera sama ada bahan yang diperlukan ada, dan jika ia tidak ada, anda boleh mengurangkan dengan ketara eksperimen selanjutnya untuk mengenal pastinya. Tindak balas ini termasuk ninhidrin, yang merupakan tindak balas utama dalam penentuan visual sebatian amino.
Apakah ini?
Ninhidrin ialah sebatian dikarbonil yang mengandungi satu cincin aromatik dengan heterokitar yang melekat padanya, atom kedua yang mempunyai 2 kumpulan hidroksil (OH-). Bahan ini diperoleh melalui pengoksidaan langsung inandione - 1, 3, dan, oleh itu, mengikut tatanama antarabangsa, ia mempunyai nama berikut: 2, 2 - dihydroxyinandione -1, 3 (Gamb. 1).
Ninhidrin tulen ialah kristal kuning atau putihwarna yang, apabila dipanaskan, larut dengan baik dalam air dan pelarut organik polar lain, seperti aseton. Ini adalah bahan yang agak berbahaya, jika ia bersentuhan dengan kulit dalam kuantiti yang banyak atau membran mukus, ia menyebabkan kerengsaan, termasuk apabila terhidu. Bekerja dengan sebatian ini hendaklah berhati-hati dan hanya dengan sarung tangan, kerana apabila ia bersentuhan dengan kulit, ia bertindak balas dengan protein sel kulit dan mengotorkannya dengan warna ungu.
Bahan Reaktif
Seperti yang dinyatakan di atas, tindak balas ninhidrin digunakan terutamanya untuk penentuan visual kandungan sebatian amino:
- α-asid amino (termasuk dalam protein);
- gula amino;
- alkaloid yang mengandungi –NH2 dan kumpulan -NH;
- pelbagai amina.
Perlu diingat bahawa amina sekunder dan tersier kadangkala bertindak balas dengan sangat lemah, jadi lebih banyak kajian diperlukan untuk mengesahkan kehadirannya.
Pelbagai kaedah kromatografi digunakan untuk penentuan kuantitatif, contohnya, kromatografi kertas (BC), kromatografi lapisan nipis (TLC) atau dengan mencuci pembawa pepejal dengan larutan ninhidrin dalam pelbagai media.
Tindak balas ini tidak khusus untuk sebatian amino, kerana reagen boleh masuk ke dalamnya dengan semua sekali gus. Walau bagaimanapun, pada bahagian produk tindak balas, ia mempunyai keanehan dalam bentuk pembebasan gelembung karbon dioksida (CO2), dan ini adalah tipikal hanya apabila berinteraksi dengan α-amino asid.
Ciri mekanisme
BTerdapat tafsiran yang berbeza bagi persamaan tindak balas ninhidrin dalam literatur. Sesetengah penyelidik meninggalkan pembentukan hidrindantin daripada 2-aminoinandione, yang, dengan penyertaan ammonia dan ninhidrin, juga membentuk bahan pewarna yang dipanggil "Ungu Rueman" (atau "biru Rueman"), manakala yang lain, sebaliknya, menganggap hanya penyertaan tanpa kehadiran produk amino perantaraan. Terdapat juga beberapa perkara menarik dalam rekod tindak balas itu sendiri, khususnya, ini melibatkan kaedah melekatkan derivatif amino ninhidrin pada molekul utamanya untuk membentuk pewarna. Petunjuk tempat "hidrogen berjalan" yang diperolehi oleh amina perantaraan daripada medium akueus juga masih dipersoalkan: ia boleh sama ada dalam kumpulan keton atau di sebelah –NH2.
Pada hakikatnya, nuansa dengan atom H adalah tidak penting, kerana kedudukannya dalam sebatian tidak memainkan peranan khas dalam perjalanan tindak balas, jadi ia tidak perlu diberi perhatian. Bagi peninggalan salah satu peringkat yang mungkin, sebab di sini terletak pada aspek teori: sehingga kini, mekanisme yang tepat untuk pembentukan ungu Rueman belum ditentukan dengan tepat, jadi skema tindak balas ninhidrin yang agak berbeza boleh didapati.
Cara interaksi reagen yang paling lengkap dengan sebatian amino akan dicadangkan di bawah.
Mekanisme tindak balas
Pertama, ninhidrin berinteraksi dengan asid α-amino, melekatkannya pada tapak pembelahan kumpulan hidroksi dan membentuk hasil pemeluwapan (Rajah 2a). Kemudian yang terakhir dimusnahkan, melepaskan amina perantaraan, aldehid, dan karbon dioksida (Rajah 2b). Dari produk akhir apabila menyertaininhidrin, struktur ungu Rueman (diketonhydrindenketohydrinamine, Rajah 2c) disintesis. Turut ditunjukkan ialah kemungkinan pembentukan hidrindantin (ninhidrin terkurang) daripada amina perantaraan, yang juga bertukar menjadi sebatian pewarna dengan kehadiran ammonia (lebih tepat, ammonium hidroksida) dengan lebihan reagen itu sendiri (Rajah 2d).
Pembentukan hidrindantin telah dibuktikan oleh Rueman sendiri apabila hidrogen sulfida bertindak ke atas molekul ninhidrin. Kompaun ini mampu larut dalam natrium karbonat Na2CO3, mewarnai larutan merah gelap. Dan apabila asid hidroklorik cair ditambah, hidrindantin akan mendakan.
Kemungkinan besar, amina perantaraan, hidridantin, ninhidrin dan struktur pewarna, disebabkan ketidakstabilan apabila dipanaskan, berada dalam beberapa keseimbangan, yang membolehkan kehadiran beberapa peringkat tambahan.
Mekanisme ini sesuai untuk menerangkan tindak balas ninhidrin dengan sebatian amino lain, kecuali hasil sampingan yang terhasil daripada penyingkiran struktur yang lain daripada –NH2, -NH atau -N.
Ujian biuret dan tindak balas lain terhadap protein
Analisis kualitatif untuk ikatan peptida walaupun struktur bukan protein boleh berlaku bukan sahaja dengan penyertaan reagen di atas. Walau bagaimanapun, dalam kes tindak balas ninhidrin terhadap protein, interaksi tidak berlaku di sepanjang kumpulan –CO-NH‒, tetapi di sepanjang kumpulan amina. Terdapat apa yang dipanggil "tindak balas biuret", yang dicirikan oleh penambahan ion kepada larutan dengan sebatian aminokuprum bivalen daripada CuSO4 atau Cu(OH)2 dalam medium beralkali (Rajah 3).
Semasa analisis, dengan adanya struktur yang diperlukan, larutan bertukar menjadi biru tua kerana pengikatan ikatan peptida menjadi kompleks warna, yang membezakan satu reagen daripada yang lain. Itulah sebabnya tindak balas biuret dan ninhidrin adalah universal berhubung dengan struktur protein dan bukan protein dengan kumpulan –CO-NH‒.
Apabila menentukan asid amino kitaran, tindak balas xantoprotein dengan larutan pekat asid nitrik HNO3 digunakan, yang memberikan warna kuning apabila dinitrat. Setitik reagen pada kulit juga menunjukkan warna kuning dengan bertindak balas dengan asid amino dalam sel kulit. Asid nitrik boleh menyebabkan melecur dan juga harus dikendalikan dengan sarung tangan.
Contoh interaksi dengan sebatian amino
Tindak balas Ninhidrin untuk asid α-amino memberikan hasil visual yang baik, kecuali struktur prolin warna dan hidroksiprolin, yang bertindak balas dengan pembentukan warna kuning. Penjelasan yang mungkin untuk kesan ini ditemui dalam keadaan persekitaran lain bagi interaksi ninhidrin dengan struktur ini.
Tindak balas dengan kumpulan amino
Memandangkan ujian tidak khusus, pengesanan visual alanin menggunakan tindak balas ninhidrin dalam campuran tidak dapat dilakukan. Walau bagaimanapun, dengan kromatografi kertas, apabila menggunakan sampel pelbagai asid α-amino, menyemburkannya dengan larutan akueus ninhidrin dan berkembang dalam medium khas, seseorang bolehhitung komposisi kuantitatif bukan sahaja kompaun yang dituntut, tetapi juga banyak lagi.
Secara skematik, interaksi alanin dengan ninhidrin mengikut prinsip yang sama. Ia melekat pada reagen pada kumpulan amina, dan di bawah tindakan ion hidronium aktif (H3O+) terbahagi pada karbon -ikatan nitrogen, terurai menjadi asetaldehid (CH3COH) dan karbon dioksida (CO2). Satu lagi molekul ninhidrin melekat pada nitrogen, menyesarkan molekul air, dan struktur pewarna terbentuk (Rajah 4).
Tindak balas dengan sebatian amino heterosiklik
Tindak balas ninhidrin dengan prolin adalah khusus, terutamanya dalam analisis kromatografi, kerana struktur sedemikian dalam medium asid mula-mula menjadi kuning, dan kemudian bertukar menjadi ungu dalam medium neutral. Para penyelidik menerangkan ini dengan ciri penyusunan semula kitaran dalam sebatian perantaraan, yang dipengaruhi dengan tepat oleh kehadiran sejumlah besar proton hidrogen yang melengkapkan tahap tenaga luaran nitrogen.
Pemusnahan heterokitar tidak berlaku, dan molekul ninhidrin lain dilekatkan padanya pada atom karbon ke-4. Apabila dipanaskan lagi, struktur yang terhasil dalam medium neutral bertukar menjadi ungu Rueman (Rajah 5).
Penyediaan reagen utama
Ujian Ninhidrin dijalankan dengan larutan yang berbeza, bergantung pada pelarutan struktur amino dalam organik dansebatian tak organik.
Reagen utama ialah penyediaan larutan 0.2% dalam air. Ini adalah campuran serba boleh, kerana kebanyakan sebatian larut dengan baik dalam H2O. Untuk mendapatkan reagen yang baru disediakan, sampel 0.2 g ninhidrin tulen secara kimia dicairkan dalam 100 ml air.
Perlu diperhatikan bahawa untuk sesetengah penyelesaian yang dianalisis kepekatan ini tidak mencukupi, jadi 1% atau 2% penyelesaian boleh disediakan. Ini adalah tipikal untuk ekstrak daripada bahan mentah perubatan, kerana ia mengandungi pelbagai kelas sebatian amino.
Apabila menjalankan kajian kromatografi, larutan, contohnya, apabila membasuh campuran pada pembawa pepejal melalui lajur, boleh disediakan dalam alkohol, dimetil sulfoksida, aseton dan pelarut polar lain - semuanya akan bergantung pada pelarut tertentu struktur amino.
Permohonan
Tindak balas ninhidrin memungkinkan untuk mengesan banyak sebatian amino dalam larutan, yang menjadikannya salah satu yang pertama digunakan dalam analisis kualitatif bahan organik. Penentuan visual mengurangkan dengan ketara bilangan eksperimen, terutamanya apabila menganalisis tumbuhan, ubat dan bentuk dos yang kurang dikaji, serta penyelesaian dan campuran yang tidak diketahui.
Dalam sains forensik, kaedah ini digunakan secara meluas untuk menentukan kehadiran kesan peluh pada sebarang permukaan.
Walaupun tiada kekhususan tindak balas, penarikan balik tindak balas ninhidrin daripada amalan kimia adalah mustahil, keranamenggantikan bahan ini dengan analog yang kurang toksik (contohnya, oxolin) membuktikan bahawa mereka mempunyai kepekaan yang lebih lemah kepada kumpulan amino dan tidak memberikan hasil yang baik dalam analisis fotometrik.
