Penyerapan dan pancaran semula cahaya selanjutnya oleh media bukan organik dan organik adalah hasil daripada pendarfluor atau pendarfluor. Perbezaan antara fenomena adalah panjang selang antara penyerapan cahaya dan pelepasan aliran. Dengan pendarfluor, proses ini berlaku hampir serentak, dan dengan pendarfluor, dengan sedikit kelewatan.
Latar belakang sejarah
Pada tahun 1852, saintis British Stokes pertama kali menerangkan pendarfluor. Dia mencipta istilah baharu itu hasil daripada eksperimennya dengan fluorspar, yang memancarkan cahaya merah apabila terdedah kepada cahaya ultraungu. Stokes mencatatkan satu fenomena yang menarik. Dia mendapati bahawa panjang gelombang cahaya pendarfluor sentiasa lebih panjang daripada cahaya pengujaan.
Banyak eksperimen telah dijalankan pada abad ke-19 untuk mengesahkan hipotesis. Mereka menunjukkan bahawa pelbagai sampel berpendar apabila terdedah kepada cahaya ultraungu. Bahan termasuk, antara lain, kristal, resin, mineral, klorofil,bahan mentah perubatan, sebatian tak organik, vitamin, minyak. Penggunaan langsung pewarna untuk analisis biologi bermula hanya pada tahun 1930
Perihalan mikroskop pendarfluor
Beberapa bahan yang digunakan dalam penyelidikan pada separuh pertama abad ke-20 adalah sangat spesifik. Terima kasih kepada penunjuk yang tidak dapat dicapai dengan kaedah kontras, kaedah mikroskopi pendarfluor telah menjadi alat penting dalam kedua-dua penyelidikan bioperubatan dan biologi. Keputusan yang diperolehi adalah penting untuk sains bahan.
Apakah faedah mikroskopi pendarfluor? Dengan bantuan bahan baharu, ia menjadi mungkin untuk mengasingkan sel yang sangat spesifik dan komponen submikroskopik. Mikroskop pendarfluor membolehkan anda mengesan molekul individu. Pelbagai pewarna membolehkan anda mengenal pasti beberapa elemen pada masa yang sama. Walaupun resolusi spatial peralatan dihadkan oleh had pembelauan, yang, seterusnya, bergantung pada sifat khusus sampel, pengesanan molekul di bawah tahap ini juga agak mungkin. Pelbagai sampel mempamerkan autofluoresensi selepas penyinaran. Fenomena ini digunakan secara meluas dalam industri petrologi, botani, semikonduktor.
Ciri
Kajian tisu haiwan atau mikroorganisma patogen selalunya rumit oleh autofluoresensi tidak spesifik yang terlalu lemah atau sangat kuat. Walau bagaimanapun, nilai dalampenyelidikan memperoleh pengenalan ke dalam bahan komponen teruja pada panjang gelombang tertentu dan memancarkan fluks cahaya keamatan yang diperlukan. Fluorochromes bertindak sebagai pewarna yang mampu melekat sendiri pada struktur (tidak kelihatan atau kelihatan). Pada masa yang sama, mereka dibezakan oleh selektiviti tinggi berkenaan dengan sasaran dan hasil kuantum.
Mikroskop pendarfluor telah digunakan secara meluas dengan kemunculan pewarna semula jadi dan sintetik. Ia mempunyai profil keamatan pelepasan dan pengujaan khusus serta disasarkan kepada sasaran biologi tertentu.
Pengenalpastian molekul individu
Selalunya, dalam keadaan ideal, anda boleh mendaftarkan cahaya satu elemen. Untuk melakukan ini, antara lain, adalah perlu untuk memastikan bunyi pengesan dan latar belakang optik yang cukup rendah. Molekul fluorescein boleh memancarkan sehingga 300,000 foton sebelum dimusnahkan akibat pelunturan foto. Dengan kadar kutipan 20% dan kecekapan proses, mereka boleh didaftarkan dalam jumlah kira-kira 60 ribu
Mikroskop pendarfluor, berdasarkan fotodiod longsoran atau pendaraban elektron, membenarkan penyelidik memerhati tingkah laku molekul individu selama beberapa saat, dan dalam beberapa kes beberapa minit.
Kesukaran
Masalah utama ialah penindasan hingar daripada latar belakang optik. Disebabkan fakta bahawa banyak bahan yang digunakan dalam pembinaan penapis dan kanta mempamerkan beberapa autofluoresensi, usaha saintis pada peringkat awal tertumpu pada pengeluarankomponen dengan pendarfluor rendah. Walau bagaimanapun, eksperimen seterusnya membawa kepada kesimpulan baru. Khususnya, mikroskop pendarfluor berdasarkan jumlah pantulan dalaman didapati mencapai latar belakang rendah dan output cahaya pengujaan tinggi.
Mekanisme
Prinsip mikroskop pendarfluor berdasarkan pantulan dalaman total adalah menggunakan gelombang yang cepat mereput atau tidak merambat. Ia timbul pada antara muka antara media dengan indeks biasan yang berbeza. Dalam kes ini, pancaran cahaya melalui prisma. Ia mempunyai indeks biasan yang tinggi.
Prisma bersebelahan dengan larutan akueus atau kaca parameter rendah. Jika pancaran cahaya diarahkan kepadanya pada sudut yang lebih besar daripada yang kritikal, pancaran itu dipantulkan sepenuhnya dari antara muka. Fenomena ini, seterusnya, menimbulkan gelombang tidak merambat. Dalam erti kata lain, medan elektromagnet dihasilkan yang menembusi medium dengan indeks biasan yang lebih rendah pada jarak kurang daripada 200 nanometer.
Dalam gelombang tidak merambat, keamatan cahaya akan cukup untuk merangsang fluorofor. Walau bagaimanapun, disebabkan kedalaman yang sangat cetek, isipadunya akan menjadi sangat kecil. Hasilnya ialah latar belakang peringkat rendah.
Pengubahsuaian
Mikroskop pendarfluor berdasarkan pantulan dalaman total boleh direalisasikan dengan pencahayaan epi. Ini memerlukan kanta dengan apertur berangka yang meningkat (sekurang-kurangnya 1.4, tetapi adalah wajar ia mencapai 1.45-1.6), serta medan radas yang diterangi sebahagiannya. Yang terakhir dicapai dengan tempat kecil. Untuk keseragaman yang lebih besar, cincin nipis digunakan, di mana bahagian aliran disekat. Untuk mendapatkan sudut genting selepas pantulan total berlaku, tahap pembiasan yang tinggi bagi medium rendaman dalam kanta dan kaca penutup mikroskop diperlukan.
