Protein ialah komponen penting bagi semua organisma. Setiap molekulnya terdiri daripada satu atau lebih rantai polipeptida yang terdiri daripada asid amino. Walaupun maklumat yang diperlukan untuk kehidupan dikodkan dalam DNA atau RNA, protein rekombinan melaksanakan pelbagai fungsi biologi dalam organisma, termasuk pemangkinan enzimatik, perlindungan, sokongan, pergerakan dan peraturan. Mengikut fungsi mereka dalam badan, bahan-bahan ini boleh dibahagikan kepada kategori yang berbeza, seperti antibodi, enzim, komponen struktur. Memandangkan fungsi pentingnya, sebatian tersebut telah dikaji secara intensif dan digunakan secara meluas.
Pada masa lalu, cara utama untuk mendapatkan protein rekombinan ialah mengasingkannya daripada sumber semula jadi, yang biasanya tidak cekap dan memakan masa. Kemajuan terkini dalam teknologi molekul biologi telah memungkinkan untuk mengklonkan pengekodan DNA set bahan tertentu menjadi vektor ekspresi untuk bahan seperti bakteria, yis, sel serangga dan sel mamalia.
Ringkasnya, protein rekombinan diterjemahkan oleh produk DNA eksogen ke dalamsel hidup. Mendapatkannya biasanya melibatkan dua langkah utama:
- Mengklon molekul.
- Ekspresi protein.
Pada masa ini, penghasilan struktur sedemikian adalah salah satu kaedah paling berkuasa yang digunakan dalam perubatan dan biologi. Komposisi ini mempunyai aplikasi yang luas dalam penyelidikan dan bioteknologi.
Arahan perubatan
Protein rekombinan menyediakan rawatan penting untuk pelbagai penyakit seperti diabetes, kanser, penyakit berjangkit, hemofilia dan anemia. Formulasi biasa bahan tersebut termasuk antibodi, hormon, interleukin, enzim, dan antikoagulan. Terdapat keperluan yang semakin meningkat untuk formulasi rekombinan untuk kegunaan terapeutik. Ia membolehkan anda mengembangkan kaedah rawatan.
protein rekombinan yang direka bentuk secara genetik memainkan peranan penting dalam pasaran ubat terapeutik. Sel mamalia pada masa ini menghasilkan agen terapeutik yang paling banyak kerana formulasinya mampu menghasilkan bahan berkualiti tinggi seperti semula jadi. Di samping itu, banyak protein terapeutik rekombinan yang diluluskan dihasilkan dalam E. coli kerana genetik yang baik, pertumbuhan pesat, dan produktiviti yang tinggi. Ia juga mempunyai kesan positif terhadap perkembangan ubat berdasarkan bahan ini.
Penyelidikan
Mendapatkan protein rekombinan adalah berdasarkan kaedah yang berbeza. Bahan membantu untuk mengetahui prinsip asas dan asas badan. Molekul ini boleh digunakan untuk mengenal pasti dan menentukanlokasi bahan yang dikodkan oleh gen tertentu, dan untuk mendedahkan fungsi gen lain dalam pelbagai aktiviti selular seperti isyarat sel, metabolisme, pertumbuhan, replikasi dan kematian, transkripsi, terjemahan dan pengubahsuaian sebatian yang dibincangkan dalam artikel.
Oleh itu, komposisi yang diperhatikan sering digunakan dalam biologi molekul, biologi sel, biokimia, kajian struktur dan biofizikal dan banyak lagi bidang sains. Pada masa yang sama, mendapatkan protein rekombinan ialah amalan antarabangsa.
Kompaun sedemikian ialah alat yang berguna dalam memahami interaksi antara sel. Mereka telah terbukti berkesan dalam beberapa kaedah makmal seperti ELISA dan imunohistokimia (IHC). Protein rekombinan boleh digunakan untuk membangunkan ujian enzim. Apabila digunakan dalam kombinasi dengan sepasang antibodi yang sesuai, sel boleh digunakan sebagai piawai untuk teknologi baharu.
Bioteknologi
Protein rekombinan yang mengandungi jujukan asid amino juga digunakan dalam industri, pengeluaran makanan, pertanian dan kejuruteraan bio. Contohnya, dalam penternakan, enzim boleh ditambah pada makanan untuk meningkatkan nilai pemakanan bahan makanan, mengurangkan kos dan pembaziran, menyokong kesihatan usus haiwan, meningkatkan produktiviti dan menambah baik alam sekitar.
Selain itu, bakteria asid laktik (LAB) untuk jangka masa yang lamatelah digunakan untuk menghasilkan makanan yang ditapai, dan baru-baru ini LAB telah dibangunkan untuk ekspresi protein rekombinan yang mengandungi urutan asid amino, yang boleh digunakan secara meluas, contohnya, untuk memperbaiki pencernaan manusia, haiwan dan pemakanan.
Walau bagaimanapun, bahan ini juga mempunyai had:
- Dalam sesetengah kes, penghasilan protein rekombinan adalah kompleks, mahal dan memakan masa.
- Bahan yang dihasilkan dalam sel mungkin tidak sepadan dengan bentuk semula jadi. Perbezaan ini boleh mengurangkan keberkesanan protein rekombinan terapeutik dan juga menyebabkan kesan sampingan. Selain itu, perbezaan ini mungkin menjejaskan keputusan percubaan.
- Masalah utama semua ubat rekombinan ialah imunogenik. Semua produk bioteknologi boleh mempamerkan beberapa bentuk imunogenik. Sukar untuk meramalkan keselamatan protein terapeutik baharu.
Secara umumnya, kemajuan dalam bioteknologi telah meningkat dan memudahkan penghasilan protein rekombinan untuk pelbagai aplikasi. Walaupun ia masih mempunyai beberapa kelemahan, bahan tersebut penting dalam perubatan, penyelidikan dan bioteknologi.
Pautan penyakit
protein rekombinan tidak berbahaya kepada manusia. Ia hanya sebahagian daripada keseluruhan molekul dalam pembangunan ubat atau unsur pemakanan tertentu. Banyak kajian perubatan telah menunjukkan bahawa ekspresi paksa protein FGFBP3 (disingkat BP3) dalam strain makmal tikus obes menunjukkan pengurangan ketara dalam lemak badan mereka.jisim, walaupun kecenderungan genetik untuk digunakan.
Hasil ujian ini menunjukkan bahawa protein FGFBP3 mungkin menawarkan terapi baharu untuk gangguan yang berkaitan dengan sindrom metabolik seperti diabetes jenis 2 dan penyakit hati berlemak. Tetapi kerana BP3 adalah protein semula jadi dan bukan ubat tiruan, ujian klinikal BP3 manusia rekombinan boleh bermula selepas pusingan akhir kajian praklinikal. Pada, iaitu, terdapat sebab yang berkaitan dengan keselamatan menjalankan kajian tersebut. Protein rekombinan tidak berbahaya kepada manusia kerana pemprosesan dan penulenannya secara berperingkat. Perubahan berlaku pada peringkat molekul juga.
PD-L2, salah satu pemain utama dalam imunoterapi, telah dicalonkan untuk Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Perubatan 2018. Kerja ini, yang dimulakan oleh Prof. James P. Allison dari Amerika Syarikat dan Prof. Tasuku Honjo dari Jepun, telah membawa kepada rawatan kanser seperti melanoma, kanser paru-paru, dan lain-lain berdasarkan imunoterapi pusat pemeriksaan. Baru-baru ini, AMSBIO telah menambah produk baharu utama pada barisan imunoterapinya, pengaktif PD-L2/TCR - Talian Sel Rekombinan CHO.
Dalam eksperimen bukti konsep, penyelidik di Universiti Alabama di Birmingham, diketuai oleh H. Long Zheng, MD, Profesor Robert B. Adams, dan Pengarah Perubatan Makmal, Jabatan Patologi, UAB School of Perubatan, telah menyerlahkan terapi berpotensi gangguan pendarahan yang jarang berlaku tetapi membawa maut, TTP.
Hasil inikajian menunjukkan buat kali pertama bahawa transfusi platelet yang dimuatkan dengan rADAMTS13 mungkin merupakan pendekatan terapeutik yang baru dan berpotensi berkesan untuk trombosis arteri yang dikaitkan dengan TTP kongenital dan pengantara imun.
Protein rekombinan bukan sahaja nutrien, tetapi juga ubat dalam komposisi ubat yang sedang dibangunkan. Ini hanyalah beberapa bidang yang kini terlibat dalam perubatan dan berkaitan dengan kajian semua elemen strukturnya. Seperti yang ditunjukkan oleh amalan antarabangsa, struktur bahan memungkinkan pada peringkat molekul untuk menangani banyak masalah serius dalam tubuh manusia.
Pembangunan vaksin
Protein rekombinan ialah set molekul tertentu yang boleh dimodelkan. Sifat serupa digunakan dalam pembangunan vaksin. Strategi vaksinasi baharu, juga dikenali sebagai penggunaan suntikan virus rekombinan khas, boleh melindungi berjuta-juta ayam berisiko daripada penyakit pernafasan yang serius, kata penyelidik dari Universiti Edinburgh dan Institut Pirbright. Vaksin ini menggunakan versi virus atau bakteria yang tidak berbahaya atau lemah untuk memperkenalkan kuman ke dalam sel badan. Dalam kes ini, pakar menggunakan virus rekombinan dengan protein spike yang berbeza sebagai vaksin untuk mencipta dua versi virus yang tidak berbahaya. Terdapat banyak ubat berbeza yang dibina di sekitar sambungan ini.
Nama dagangan dan analog protein rekombinan adalah seperti berikut:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Ini terutamanya ubat antikanser, tetapi terdapat kawasan rawatan lain yang dikaitkan dengan bahan aktif ini.
Vaksin baharu, juga dipanggil LASSARAB, direka untuk melindungi orang ramai daripada demam Lassa dan rabies, telah menunjukkan hasil yang menjanjikan dalam kajian praklinikal, menurut satu kajian baharu yang diterbitkan dalam jurnal saintifik Nature Communications. Calon vaksin rekombinan yang tidak aktif menggunakan virus rabies yang lemah.
Pasukan penyelidik memasukkan bahan genetik virus Lassa ke dalam vektor virus rabies supaya vaksin itu akan mengekspresikan protein permukaan dalam kedua-dua sel Lassa dan rabies. Sebatian permukaan ini menimbulkan tindak balas imun terhadap agen berjangkit. Vaksin ini kemudiannya dinyahaktifkan untuk "memusnahkan" virus rabies hidup yang digunakan untuk membuat pembawa.
Mendapatkan Kaedah
Terdapat beberapa sistem untuk menghasilkan bahan. Kaedah umum untuk mendapatkan protein rekombinan adalah berdasarkan mendapatkan bahan biologi daripada sintesis. Tetapi ada cara lain.
Pada masa ini terdapat lima sistem ekspresi utama:
- Sistem ekspresi E. coli.
- Sistem ekspresi yis.
- Sistem ekspresi sel serangga.
- Sistem ekspresi sel mamalia.
- Sistem ekspresi protein bebas sel.
Pilihan terakhir amat sesuai untuk ekspresi protein transmembrandan sebatian toksik. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, bahan-bahan yang sukar diungkapkan dengan kaedah intraselular konvensional telah berjaya diintegrasikan ke dalam sel secara in vitro. Di Belarus, pengeluaran protein rekombinan digunakan secara meluas. Terdapat beberapa perusahaan milik kerajaan yang menangani isu ini.
Sistem Sintesis Protein Bebas Sel ialah kaedah yang pantas dan cekap untuk mensintesis bahan sasaran dengan menambahkan pelbagai substrat dan sebatian tenaga yang diperlukan untuk transkripsi dan terjemahan dalam sistem enzimatik ekstrak selular. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, kelebihan kaedah bebas sel untuk jenis bahan seperti membran toksik yang kompleks telah muncul secara beransur-ansur, menunjukkan potensi penggunaannya dalam bidang biofarmaseutikal.
Teknologi bebas sel boleh menambah pelbagai asid amino bukan semula jadi dengan mudah dan secara terkawal untuk mencapai proses pengubahsuaian kompleks yang sukar diselesaikan selepas ekspresi rekombinan konvensional. Kaedah sedemikian mempunyai nilai aplikasi yang tinggi dan berpotensi untuk penghantaran ubat dan pembangunan vaksin menggunakan zarah seperti virus. Sebilangan besar protein membran telah berjaya diekspresikan dalam sel bebas.
Ekspresi gubahan
Protein rekombinan CFP10-ESAT 6 dihasilkan dan digunakan untuk mencipta vaksin. Alergen tuberkulosis sedemikian membolehkan anda menguatkan sistem imun dan membangunkan antibodi. Secara umum, kajian molekul melibatkan kajian tentang mana-mana aspek protein, seperti struktur, fungsi, pengubahsuaian, penyetempatan atau interaksi. Untuk menerokabagaimana bahan tertentu mengawal proses dalaman, penyelidik biasanya memerlukan cara untuk menghasilkan sebatian berfungsi yang menarik dan bermanfaat.
Memandangkan saiz dan kerumitan protein, sintesis kimia bukanlah pilihan yang sesuai untuk usaha ini. Sebaliknya, sel hidup dan jentera selularnya biasanya digunakan sebagai kilang untuk mencipta dan membina bahan berdasarkan templat genetik yang disediakan. Sistem ekspresi protein rekombinan kemudian menjana struktur yang diperlukan untuk mencipta ubat. Seterusnya ialah pemilihan bahan yang diperlukan untuk kategori ubat yang berbeza.
Tidak seperti protein, DNA mudah dibina secara sintetik atau in vitro menggunakan teknik rekombinan yang mantap. Oleh itu, templat DNA gen tertentu, dengan atau tanpa tambahan jujukan wartawan atau jujukan tag perkaitan, boleh direka bentuk sebagai templat untuk ekspresi bahan yang dipantau. Sebatian sedemikian yang diperoleh daripada templat DNA sedemikian dipanggil protein rekombinan.
Strategi tradisional untuk ekspresi bahan melibatkan pemindahan sel dengan vektor DNA yang mengandungi templat dan kemudian mengkultur sel untuk menyalin dan menterjemahkan protein yang dikehendaki. Lazimnya, sel-sel kemudiannya dilisiskan untuk mengekstrak sebatian yang dinyatakan untuk penulenan seterusnya. Protein rekombinan CFP10-ESAT6 diproses dengan cara ini dan melalui sistem penulenan daripada kemungkinanpembentukan toksin. Hanya selepas itu ia akan disintesis menjadi vaksin.
Kedua-dua sistem ekspresi in vivo prokariotik dan eukariotik untuk bahan molekul digunakan secara meluas. Pilihan sistem bergantung pada jenis protein, keperluan untuk aktiviti berfungsi, dan hasil yang diingini. Sistem ekspresi ini termasuk mamalia, serangga, yis, bakteria, alga dan sel. Setiap sistem mempunyai kelebihan dan cabarannya sendiri, dan memilih sistem yang sesuai untuk aplikasi tertentu adalah penting untuk menjayakan ekspresi bahan yang sedang disemak.
Ekspresi daripada mamalia
Penggunaan protein rekombinan membolehkan pembangunan vaksin dan ubat dari pelbagai peringkat. Untuk ini, kaedah mendapatkan bahan ini boleh digunakan. Sistem ekspresi mamalia boleh digunakan untuk menghasilkan protein daripada alam haiwan yang mempunyai struktur dan aktiviti asli yang paling banyak disebabkan oleh persekitaran fisiologinya yang berkaitan. Ini menghasilkan tahap pemprosesan pasca terjemahan dan aktiviti berfungsi yang tinggi. Sistem ekspresi mamalia boleh digunakan untuk menghasilkan antibodi, protein kompleks dan sebatian untuk digunakan dalam ujian berfungsi berasaskan sel. Walau bagaimanapun, faedah ini digabungkan dengan syarat budaya yang lebih ketat.
Sistem ekspresi mamalia boleh digunakan untuk menjana protein secara sementara atau melalui garisan sel yang stabil di mana binaan ekspresi disepadukan ke dalam genom hos. Walaupun sistem sedemikian boleh digunakan dalam pelbagai eksperimen, masapengeluaran boleh menjana sejumlah besar bahan dalam masa satu hingga dua minggu. Jenis bioteknologi protein rekombinan ini mendapat permintaan tinggi.
Sistem ekspresi mamalia sementara yang menghasilkan tinggi ini menggunakan kultur ampaian dan boleh menghasilkan gram seliter. Di samping itu, protein ini mempunyai lebih banyak pengubahsuaian lipatan asli dan selepas terjemahan seperti glikosilasi berbanding sistem ekspresi lain.
Ekspresi Serangga
Kaedah untuk menghasilkan protein rekombinan tidak terhad kepada mamalia. Terdapat juga cara yang lebih produktif dari segi kos pengeluaran, walaupun hasil bahan bagi setiap 1 liter cecair yang dirawat adalah jauh lebih rendah.
Sel serangga boleh digunakan untuk mengekspresikan protein tahap tinggi dengan pengubahsuaian yang serupa dengan sistem mamalia. Terdapat beberapa sistem yang boleh digunakan untuk menjana baculovirus rekombinan, yang kemudiannya boleh digunakan untuk mengekstrak bahan yang menarik dalam sel serangga.
Ekspresi protein rekombinan boleh ditingkatkan dengan mudah dan disesuaikan dengan budaya ampaian berketumpatan tinggi untuk pengkompaunan molekul berskala besar. Mereka lebih berfungsi sama dengan komposisi asli bahan mamalia. Walaupun hasil boleh sehingga 500 mg/L, penghasilan baculovirus rekombinan boleh memakan masa dan keadaan kultur lebih sukar daripada sistem prokariotik. Walau bagaimanapun, di lebih banyak negara selatan dan lebih panas, yang serupakaedah dianggap lebih cekap.
Ekspresi bakteria
Penghasilan protein rekombinan boleh diwujudkan dengan bantuan bakteria. Teknologi ini jauh berbeza daripada yang dinyatakan di atas. Sistem ekspresi protein bakteria popular kerana bakteria mudah dikultur, tumbuh dengan cepat, dan memberikan hasil yang tinggi bagi rumusan rekombinan. Walau bagaimanapun, bahan eukariotik berbilang domain yang dinyatakan dalam bakteria selalunya tidak berfungsi kerana sel tidak dilengkapi untuk melakukan pengubahsuaian selepas translasi atau lipatan molekul yang diperlukan.
Selain itu, banyak protein menjadi tidak larut sebagai molekul kemasukan, yang sangat sukar untuk pulih tanpa denaturator yang keras dan prosedur lipatan semula molekul yang menyusahkan. Kaedah ini kebanyakannya dianggap sebagai sebahagian besarnya masih eksperimen.
Ekspresi bebas sel
Protein rekombinan yang mengandungi urutan asid amino staphylokinase diperoleh dengan cara yang sedikit berbeza. Ia termasuk dalam pelbagai jenis suntikan, memerlukan beberapa sistem sebelum digunakan.
Ekspresi protein bebas sel ialah sintesis in vitro bahan menggunakan ekstrak keseluruhan sel yang serasi secara translasi. Pada dasarnya, ekstrak sel keseluruhan mengandungi semua makromolekul dan komponen yang diperlukan untuk transkripsi, terjemahan dan juga pengubahsuaian selepas penterjemahan.
Komponen ini termasuk polimerase RNA, faktor protein pengawalseliaan, bentuk transkripsi, ribosom dan tRNA. Apabila menambahkofaktor, nukleotida dan templat gen tertentu, ekstrak ini boleh mensintesis protein yang diminati dalam beberapa jam.
Walaupun tidak mampan untuk pengeluaran berskala besar, sistem ekspresi protein (IVT) bebas sel atau in vitro menawarkan beberapa kelebihan berbanding sistem in vivo konvensional.
Ekspresi bebas sel membolehkan sintesis pantas rumusan rekombinan tanpa melibatkan kultur sel. Sistem bebas sel memungkinkan untuk melabelkan protein dengan asid amino yang diubah suai, serta untuk menyatakan sebatian yang mengalami degradasi proteolitik yang cepat oleh protease intraselular. Di samping itu, lebih mudah untuk menyatakan banyak protein yang berbeza pada masa yang sama menggunakan kaedah bebas sel (contohnya, menguji mutasi protein dengan ekspresi berskala kecil daripada banyak templat DNA rekombinan yang berbeza). Dalam percubaan perwakilan ini, sistem IVT digunakan untuk menyatakan protein caspase-3 manusia.
Kesimpulan dan prospek masa depan
Penghasilan protein rekombinan kini boleh dilihat sebagai satu disiplin yang matang. Ini adalah hasil daripada banyak penambahbaikan tambahan dalam penulenan dan analisis. Pada masa ini, program penemuan dadah jarang dihentikan kerana ketidakupayaan untuk menghasilkan protein sasaran. Proses selari untuk ekspresi, penulenan dan analisis beberapa bahan rekombinan kini terkenal di banyak makmal di seluruh dunia.
Kompleks protein dan kejayaan yang semakin meningkat dalam pembuatanstruktur membran terlarut akan memerlukan lebih banyak perubahan untuk memenuhi permintaan. Kemunculan organisasi penyelidikan kontrak yang berkesan untuk bekalan protein yang lebih kerap akan membolehkan pengagihan semula sumber saintifik untuk menghadapi cabaran baharu ini.
Selain itu, aliran kerja selari harus membenarkan penciptaan perpustakaan lengkap bahan yang dipantau untuk membolehkan pengenalpastian sasaran baharu dan pemeriksaan lanjutan, bersama-sama dengan projek penemuan ubat molekul kecil tradisional.
